Що і коли?
Правильне управління харчуванням дріжджів включає: основні поживні речовини, необхідні на стадії росту, та визначення необхідного часу, коли їх потрібно додати.
Стратегії управління підживленням також мають бути адаптовані до умов бродіння та стресових факторів, адже різні технологічні прийоми виноробства можуть значно вплинути на вміст і доступність поживних речовин. Лише надавши дріжджам необхідні поживні речовини в відповідному дозуванні на певному етапі життєвого циклу дріжджів, можна виробляти чисті, якісні вина з мінімальними негативними тонами бродіння (H2S тощо).
АЗОТ
Після глюкози та фруктози азот є найбільш важливим поживним фактором для дріжджів. Він використовується у синтезі кількох молекул, переважно білків:
– Структурні білки, необхідні для розвитку нових клітин.
– Ферменти, необхідні для підтримки процесів метаболізму, включаючи перетворення цукрів у спирт.
– Транспортні білки, розташовані в клітинній мембрані, які регулюють обмін між зовнішнім і внутрішнім середовищем клітини дріжджів.
Без сумніву, доступність азоту є одним із ключових факторів росту і стимуляторів розмноження дріжджів та забезпечення ефективного метаболізму бродіння.
Saccharomyces cerevisiae можуть засвоювати лише прості форми азоту, такі як амоній, амінокислоти та невеликі пептиди, які складаються з двох-п’яти амінокислот.
Дріжджі поглинатимуть ці сполуки з різною швидкістю і в різних кількостях відповідно до шкали пріоритетів: амоній споживається швидше, ніж амінокислоти, деякі амінокислоти повністю засвоюються, тоді як інші — ні. Саме тому під назвою Азот, доступний для дріжджів (YAN), мають на увазі ті сполуки, які можуть ефективно використовуватися дріжджами.
Вимоги до YAN залежать від:
• Штаму дріжджів.
• Вмісту цукрів у суслі: чим вище вміст цукру, тим більша потреба в YAN.
• Кількості біомаси: чим більша популяція дріжджів, тим більше необхідно YAN.
Концентрація YAN повинна бути різною і часто є недостатньою для задоволення поживних потреб дріжджів. Коли передферментативна фаза є тривалою, як у випадку виробництва білого вина та холодної мацерації червоного вина, розвиток дикої мікрофлори призводить до виснаження поживних факторів, у тому числі азоту. Багато авторів оцінюють мінімальний вміст YAN, необхідний для повного бродіння, приблизно у 150 мг/л у суслі, що містить 200 г/л цукрів. Виходячи за межі базових потреб у харчуванні для регулярного і повного бродіння, щоб «оптимізувати сенсорну якість вина», концентрація YAN може досягати 350 мг/л і більше.
АМІНОКИСЛОТИ
Амінокислоти проникають у клітину через транспортні білки, присутні в клітинній мембрані, які потребують енергії для функціонування. Амоній пригнічує багато з цих транспортних систем. Спирт також пригнічує засвоєння амінокислот. Поглинання амінокислот пов’язане з транспортуванням одного або кількох протонів (H+). Концентрація H+ у розчині пов’язана з його pH: чим більше протонів, тим нижчий pH. Усередині клітини дріжджів значення pH становить близько 6-7 і повинно залишатися в цьому діапазоні, щоб забезпечити нормальний метаболізм.
У клітинній мембрані протонні насоси активні й виводять протони в виноградне сусло для підтримки внутрішньоклітинного балансу pH. Під час бродіння виробництво спирту робить клітинну мембрану дедалі проникнішою для H+, що спричиняє пасивну дифузію протонів у клітину.
Клітини дріжджів намагаються обмежити внутрішньоклітинне зниження pH, блокуючи транспорт амінокислот. З цієї причини дріжджі поглинають амінокислоти лише на ранніх стадіях бродіння і тільки за відсутності амонію. Після транспортування всередину клітини вони накопичуються у вакуолях, де вони резервуються та зберігаються. Це дозволяє дріжджовим клітинам використовувати амінокислоти на пізніх стадіях бродіння, коли наявність спирту перешкоджає їх споживанню.
Коли додавати амінокислоти
Відповідно до наведеного вище пояснення, додавання амінокислот необхідно проводити відразу після інокуляції, уникаючи одночасного додавання амонію. Сприяння використанню дріжджами амінокислот має ефект покращення аромату вина. Фактично, амінокислоти можна розглядати як ароматичні попередники, будівельні блоки вторинних винних ароматів. Після видалення амінної групи карбонільний скелет амінокислоти може виводитися клітиною у вигляді вищого спирту або складного ефіру, що сприяє покращенню аромату вина.
Як забезпечити дріжджі амінокислотами
Поживні речовини для бродіння, що складаються з автолізованих клітин дріжджів, є єдиним дозволеним джерелом амінокислот в енології.
АМОНІЙ
Як і амінокислоти, амоній засвоюється через активну транспортну систему, менш чутливу до дії спирту, яка зупиняється лише на пізній стадії ферментації.
Коли додавати амоній
З огляду на переважне споживання амонію дріжджами, рекомендується відкласти його додавання до кінця фази експоненціального росту, тобто приблизно на третині спиртового бродіння. У цій
фазі амоній використовується для синтезу нових, неушкоджених мембранних білків. Середня тривалість життя транспортних білків становить близько п’яти-шести годин. Було перевірено, що протягом п’ятдесяти годин повного дефіциту азоту транспортні білки припиняють функціонувати, а дріжджові клітини перестають споживати цукри.
Додавання амонію в другій половині спиртового бродіння може допомогти зменшити синтез сірководню. Однак дозування має бути помірним, оскільки наявність залишкового амонію може сприяти росту диких дріжджів, таких як Brettanomyces.
Як додавати амоній
Амоній можна подавати у формі діамонійфосфату (DAP) і сульфату амонію, максимальне дозування становить 1 г/л, що еквівалентно приблизно 200 мг/л YAN. Загальна тенденція до обмеження використання сульфату амонію обумовлена запобіганням виділення великих концентрацій сульфатів, які можуть перетворюватися на H2S.
Комбіноване використання амінокислот при додаванні дріжджів і амонію на етапі 1/3 спиртового бродіння є кращим порівняно з використанням однієї форми азоту у разовій дозі, оскільки:
– використання великої кількості солей амонію може надати вину солоний присмак і тони розчинника;
– велика кількість азоту при внесенні дріжджів стимулює надмірне розмноження дріжджів, що, у свою чергу, викликає підвищену потребу в азоті. Крім того, висока температура може викликати уповільнення або зупинку бродіння.
ФАКТОРИ ВИЖИВАННЯ: ДОВГОЛАНЦЮГОВІ ЖИРНІ КИСЛОТИ ТА СТЕРИНИ
Клітинна мембрана – це захисний бар’єр, який дозволяє дріжджам рости і виживати в суворих умовах середовища вина, яке включає кислий pH і наявність токсичних речовин, таких як діоксид сірки та спирт. Мембрана складається з амфіпатичного подвійного фосфоліпідного шару, де «залишки» довголанцюгових жирних кислот утворюють матрицю, в якій вбудовані стерини, а також структурні та транспортні білки. Для регулярного обміну між клітиною та зовнішнім середовищем клітинна мембрана повинна підтримувати постійну проникність. Накопичення спирту викликає жорсткість мембрани та підвищує проникність мембрани для протонів, що призводить до закислення цитоплазми, загибелі клітин і, як наслідок, до зупинки бродіння. Деякі дослідження показали, що втрата проникності мембрани, викликана спиртом, корелює зі зниженням вмісту стеролів та зниженням індексу ненасиченості жирних кислот. Насправді, в анаеробних умовах дріжджі не можуть синтезувати стерини та довголанцюгові ненасичені жирні кислоти. Отже, при кожному поділі клітин вміст цих речовин зменшується, поки не стане обмежувальним фактором для розмноження дріжджів і синтезу мембран.
Дефіцит стимулює вироблення ліпідів дріжджами, необхідних для відновлення мембрани, але відсутність кисню зупиняє механізм синтезу, що призводить до накопичення токсичних проміжних продуктів, таких як оцтова кислота та жирні кислоти середньої довжини ланцюга. Таким чином, дефіцит довголанцюгових жирних кислот і стеролів – одна з основних причин уповільнення бродіння та підвищеного синтезу летючих кислот.
Коли додавати довголанцюгові жирні кислоти та стерини
Довголанцюгові жирні кислоти (C16 і C18) та стерини стають необхідними для виживання дріжджів на другому етапі спиртового бродіння. Ця потреба має бути забезпечена під час розмноження, до того, як їхній дефіцит стане обмежувальним фактором. Їх можна додавати під час внесення дріжджів або на першій половині бродіння.
Як додавати довголанцюгові жирні кислоти та стерини
Сухі речовини винограду містять велику кількість довголанцюгових жирних кислот і стеролів. Надмірно освітлене біле сусло має дефіцит ліпідів. Є два варіанти компенсації:
– Додати сухі речовини назад до мутності приблизно 100-150 NTU;
– Додати дріжджові оболонки, багаті ліпідами.
КИСЕНЬ
Дріжджам потрібен кисень для синтезу стеролів і ненасичених жирних кислот. Враховуючи важливість цих ліпідів для цілісності дріжджової мембрани та виживання, кисень можна вважати поживною речовиною.
Коли додавати кисень
Активні сухі дріжджі спочатку містять велику кількість ліпідів завдяки аеробним умовам, які застосовуються під час їх виробництва. Додавання кисню має вирішальне значення на стадії від однієї третини до половини споживання цукрів. Кисень миттєво використовується дріжджами для синтезу стеролів і жирних кислот. Кількість кисню, необхідна для метаболізму дріжджів, становить приблизно 10 мг/л. Результат оксигенації – це прискорення другої половини бродіння. Цей ефект ще більше посилюється, коли кисень поєднується з додаванням амонію.
У випадку спонтанного бродіння дріжджі матимуть низький вміст ліпідів, оскільки вони не вирощуються в аеробних умовах, тому ще важливіше звернути увагу на потребу в кисні. Додавання кисню під час засіву не рекомендується, оскільки шкідливі ферменти оксидази (тирозиназа і лакказа) можуть використати його швидше, ніж дріжджі, що призводить до потемніння та окислення сусла.
Як додавати кисень
Під час бродіння кисень може бути доданий шляхом відкритого переливу, методом делестажу або з використанням обладнання для макрооксигенації.
Відкриті переливи не контролюються і не є найбезпечнішим способом насичення сусла киснем. Максимальна кількість кисню, яка може бути розчинена в суслі, становить близько 6,5 мг/л при 20 °C. Ця концентрація може бути досягнута тільки шляхом прокачування всього об’єму бродившого сусла. Для цього потрібна постійна присутність оператора, щоб забезпечити перекачування всього об’єму. Навіть у цьому випадку первинна аерація не завжди достатня для потреб дріжджів у кисні, що вимагає багаторазового перекачування.
У випадку застосування методу делестажу, окрім присутності оператора, також потрібна порожня ємність.
Використання обладнання для макрооксигенації дозволяє збільшити точність дозування, швидкість розчинення і не вимагає постійного контролю, оскільки дозуючі пристрої автоматизовані.
ФАКТОРИ РОСТУ: ВІТАМІНИ ТА МІКРОЕЛЕМЕНТИ
Вітаміни (біотин, тіамін, пантотенова кислота, інозитол і нікотинова кислота) та мікроелементи (калій, магній, фосфор, сірка, цинк, марганець тощо) використовуються як кофактори в ферментативних реакціях. Важливість вітамінів і мікроелементів дуже висока, особливо це помітно на початку бродіння, і з цієї причини їх також називають «Фактори росту». Якщо розглядати тіамін, було помічено, що додавання під час інокуляції збільшує кількість активних клітин і швидкість бродіння.
Під час виробництва вина бувають умови, які викликають дефіцит тіаміну: сильне зараження дикими дріжджами (зокрема, Kloeckera apiculata), споживання Botrytis cinerea, тривала фаза перед бродінням.
Неправильне використання діоксиду сірки викликає дефіцит тіаміну, оскільки вільний діоксид сірки може зв’язувати тіамін і робити його недоступним для дріжджів. З цієї причини тіамін необхідно додавати через 3-4 години після внесення SO2.
Багато досліджень також показали, що, хоча сусло зазвичай багате факторами росту, вони часто бувають недоступні для дріжджів, оскільки такі сполуки, як полісахариди, поліфеноли та білки, зв’язують їх. Недоліки будь-якого з цих факторів росту можуть викликати проблеми бродіння.
Коли додавати вітаміни та мікроелементи
Вітаміни та мікроелементи слід додавати одразу після інокуляції дріжджів. Потреба в цих речовинах прямо пропорційна вмісту азоту в суслі: чим вищий YAN, тим більші концентрації дріжджових клітин, тим більша потреба у вітамінах і мікроелементах. Для забезпечення їх оптимального поглинання і використання найкраще додавати ці фактори під час регідратації дріжджів.
Як додавати вітаміни та мікроелементи
Законодавство дозволяє тільки додавання тіаміну в максимальній дозі 0,06 г/гл. Інші вітаміни та мікроелементи можуть бути забезпечені використанням автолізованих дріжджів.
ВИСНОВКИ
Правильна стратегія управління харчуванням дріжджів враховує необхідні фактори харчування та на якому етапі вони мають бути надані. На перших етапах бродіння додавання амінокислот стимулює синтез ароматичних сполук і разом з вітамінами та мікроелементами дозволяє адекватне зростання популяції, не викликаючи підвищення температури бродіння.
Максимально швидке накопичення довголанцюгових жирних кислот, стеролів і амінокислот допомагає збільшити витривалість і виживаність дріжджів у другій половині бродіння.
На етапі проходження однієї третини бродіння потрібні кисень і амоній, щоб клітинна мембрана дріжджів залишалася функціональною до повного споживання цукрів.
Стратегію харчування також слід коригувати відповідно до умов бродіння (високий рівень цукру, низький рівень азоту тощо). Різні методи виноробства можуть мати значний вплив на вміст і доступність поживних речовин у суслі. Тільки забезпечивши дріжджі відповідною дозою поживних речовин у потрібний час життєвого циклу, можна виробляти чисті, якісні вина з мінімальними негативними тонами в ароматі.
